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（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
注：本期分享来源于文献，如有错误及不足之处，欢迎各位老师批评指正。
[1]Ocana-Santero G , Javier Díaz-Nido, Saúl Herranz-Martín. Future Prospects of Gene Therapy for Friedreich's Ataxia[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4):1815.
[2]ZMD Jingdong, XMD Huangui. Brain Stereotaxic Injection[J]. Springer New York, 2014.
[3]Cristina, D, Peterson, et al. AAV-Mediated Gene Delivery to the Spinal Cord by Intrathecal Injection.[J]. Methods in Molecular Biology, 2019.
[4]Gessler D J , Tai P , Jia L , et al. Intravenous Infusion of AAV for Widespread Gene Delivery to the Nervous System[M]. 2019
前期，我们给大家分享了在神经系统研究中AAV血清型和启动子的选择『是干货啊！神经研究中启动子和血清型这样选！』，本期我们与各位老师继续分享关于AAV注射方式的有关内容。目前AAV在神经系统研究中的注射方法主要有以下几种：脑实质内注射、静脉注射、脑室注射（ICV）、枕大池内注射（ICM）和鞘内注射（IT），其中ICV、ICM和IT注射是通过脑脊髓液进行传递。每种注射方式各有优缺点，研究者可根据具体的研究对象以及实验方案，选择适合的注射方式，推荐进行预实验对实验效果做初步测试，以得到更优的选择方案。
表1.四种常用AAV神经给药特点
（Ocana-Santero G et al. ，International Journal of Molecular Sciences, 2021）
脑立体定位注射，相比其他注射方式靶向性强，注射病毒体积小，但是侵入性也强，且对操作者具有很高的要求。在立体定位手术时，颅骨上常用的注射参照点是前囱，也就是中矢状冠状缝的交叉点（下图B中的十字交叉点）。具体操作步骤如下：
1. 实验动物称重，进行麻醉；
2. 待实验动物完全麻醉后，用剃毛器将动物头顶眼睛至耳朵之间的毛发剃除干净；
3. 将麻醉后的实验动物固定于脑立体定位仪上；
具体操作为：实验动物眼部涂抹青霉素眼药膏以保护其双眼；将门齿挂在门齿挂钩上，确保头部保持固定；检查左右耳杆是否在同一水平上，将左右耳杆通过外耳道插入实验动物耳内。实验动物固定好的标准为：鼻对正中，头部不动，提尾不掉，目测大脑放置水平；
4. 手术：用碘伏/ 无色葡萄糖氯己定溶液对实验动物头皮进行消毒清理，用手术刀沿中间位置剪开头皮，用镊子对表面的结缔组织进行清理，暴露实验动物的颅骨表面；然后进行调平，首先找到前囟这个坐标，并将其归零，然后向左右调平，使左右两侧处于同一水平，调整前后囟，使前后囟也在同一水平；
5. 病毒注射：通过查询实验动物的脑立体定位图谱确定待注射脑区的位置（下方图片是大鼠和小鼠的脑谱），并确定其坐标值，即ML 值（X 轴）、AP 值（Y 轴）、DV 值（Z 轴）；根据目标脑区设定好坐标，移开注射针，用颅骨钻开窗( 由于颅骨薄, 故务必注意颅骨钻的力度！！), 操作时避免伤及脑组织；微量注射器吸取病毒液，随后固定在定位仪上，根据设好的坐标进行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μL/min，注射剂量视具体实验而定。注射完毕，留针10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回针；
6. 缝合头皮并消毒, 完成脑定位注射; 将动物从脑立体定位仪取下, 回笼待苏醒; 动物苏醒后,正常喂养, 病毒注射后2-4 周可检测转基因的表达。
提示：若手术麻醉时间较长，建议不要用酒精消毒，防止酒精挥发导致动物体温过低而死亡。手术过程和苏醒过程注意保暖。
图1. 脑立体定位注射示意图
（Van der Perren A et al. JOVE-J VIS EXP. 2016）
与系统注射和实质内注射相比，鞘内给药是一种具有较低剂量要求的微创替代方法。步骤如下：
1、使用毛巾覆盖在小鼠头部和背部，露出髂嵴以下的腰部区域；用非惯用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髋骨)，手的顶部轻轻放在小鼠身体和头部上，使其保持平静。
注：在髂骨上的握力应该足够强，以固定小鼠的腿部活动，并使腿部向外和向下伸展。
2、使用惯用手食指从腰椎到骶部沿脊柱轻轻按压，同时使用非惯用手轻轻上拉小鼠，以打开椎节之间的空间，方便进针。
3、将1 ¼”号针的斜面指向小鼠头部，然后将针以70°角插入脊柱中线的腰椎处，当感觉针碰到骨头时，将针的角度调整到30°夹角，并将针插入椎节之间。
注：需多次尝试找到合适的进入点，针头进入脊柱后推针没有阻力，尾巴或后腿的反射性弹跳出现时，说明已正确入针。
4、轻轻压下注射器的活塞，将5-10μL的AAV病毒悬液注射至蛛网膜下腔。
注：注射时间控制在10-30s较好，速度太快会导致小鼠后腿抽筋，该现象会在60s内消失。
5、注射后，将针180°旋转1-2次，然后将针从脊柱中取出。
6、小鼠放回笼子观察，确认恢复正常运动功能。
注：此法适用于成年小鼠或大鼠。
系统性给药方式，侵入性较小，但是相比其他注射方式特异性也较差，因此所需病毒体积更大。步骤如下：
1、调整光源位置以便照亮显微镜区域，中等强度的光照为佳。
2、将一个新生幼鼠直接置于冰上1-3min，进行麻醉。
3、当动物在冰上麻醉时，在注射器中注满AAV病毒，注射体积不应超过100μL。
4、在显微镜下观察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻处，中指放在耳芽处，以便拉伸幼鼠的皮肤，可见颞浅静脉。
5、确定颞浅静脉。可通过皮肤看到位于耳芽前部，周围毛细血管下部，有一条隐约可见的静脉血管，从背部到腹部，汇入颈静脉，这就是颞浅静脉。
6、注射器针尖斜面插入颞静脉。可以看到针尖斜面通过皮肤的以后被血填充。轻压注射器，并注意幼鼠脸侧面的静脉变白。
1、注射异氟醚对小鼠进行麻醉，使用非惯用手手掌握住小鼠背部，将拇指放在气管正侧面，头部皮毛拢至手掌，使小鼠眼球凸起。
2、将手腕支撑在稳定的表面上，用拇指、中指和无名指握住注射器，将食指放在柱塞上方。
3、对小鼠施加轻微压力使眼睛凸出，针头对准内眦，斜面朝外，将针头以45°插入眶后窦中心约5mm；
4、使用0.5ml 28G注射器缓慢注入150-200μL病毒悬液；
5、缓慢地取出针头，确保针头不会划伤眼角膜。使用无菌纱布止血，并在眼睛上涂抹药膏助其恢复。
6、注射后，将小鼠放回笼中恢复直至清醒。
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
1、将小鼠放入约束器中，使尾巴从开口处露出。避免过度限制小鼠，以免导致其呼吸受阻。
2、在尾部涂抹70%异丙醇。
3、将小鼠尾巴拉直，可看到尾巴两侧各有一条侧脉。
4、将针尖以30°角插入侧静脉中。一旦针尖穿过了静脉的一半，重新调整针头，使其与静脉的长度一致(图3c)。如果针头插入正确，则按压注射器注射时应无阻力。
5、使用0.5ml 28G注射器缓慢注射300μLAAV病毒悬液，此时静脉颜色会变白，大约4s后，颜色恢复正常。
6、小心将针头取出，用吸水纱布按压注射部位10秒进行止血。
7、将小鼠放回笼子。
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