Cell Reports：奥古斯塔大学苏华波教授团队揭示类泛素化修饰在调节心脏成熟和代谢中的关键作用！
2023年1月19日，美国奥古斯塔大学苏华波教授研究团队在Cell Reports (IF 8.8)发表题为“Neddylation is required for perinatal cardiac development through stimulation of metabolic maturation”的研究论文。文章提出类泛素化通过调节正常的发育代谢转变，促进心肌细胞成熟和围产期心脏发育，揭示类泛素化是调节心脏成熟和代谢的关键翻译后机制。
病毒产品
AAV9-cTnT-Cre-WPRE
实验动物
NAE1F/+ 和 NAE1F/F小鼠（P1）
注射方式
皮下注射
病毒用量
高剂量：5 x 10E11 GC/pup
中剂量：0.5 x 10E11 GC/pup
低剂量：0.25 x 10E11 GC/pup
研究背景
心脏成熟对出生后心脏发育至关重要，成熟过程一旦发生中断极易导致先天性心脏病或成年时期心肌病和心力衰竭的发生。研究报道，心脏成熟涉及一系列转录因子和翻译后修饰调控，目前调节心肌细胞代谢成熟的多个关键转录因子已被揭示，例如HIF1α、ERRα和ERRγ等，然而调节心脏成熟的翻译后机制尚不清楚。神经前体细胞表达发育下调蛋白8 (NEDD8)是一种泛素样蛋白，以类泛素化方式共价修饰靶蛋白。作者先前的研究证明，NEDD8类泛素化通路与心脏内稳态及心肌病相关，并在出生后心脏中表达下调，预示类泛素化修饰可能在心脏成熟中起着不可或缺的作用。
研究结果
1.NAE1在出生后心脏的缺失可引起扩张型心肌病和心力衰竭
NAE1是目前已发现的唯一的NEDD8活化酶，敲除NAE1可完全抑制类泛素化过程。作者将不同剂量的AAV9-cTnT-Cre病毒载体通过皮下注射至新生NAE1Flox/Flox小鼠和NAE1 Flox/+小鼠体内，构建了心脏特异性NAE1敲除小鼠和对照小鼠，值得注意的是，高剂量（5 x 10E11 GC/pup）病毒注射可转导约80%的心肌细胞，NAE1的mRNA和蛋白水平均显著降低，类泛素化水平得到明显抑制。通过对这些小鼠的心脏进行表征分析，作者发现与对照组小鼠相比，NAE1敲除小鼠在病毒注射后六周发生了扩张性心肌病并最终导致心力衰竭，实时定量PCR检测到心脏应激标志物Nppa和Nppb上调，Serca2a下调。表明类泛素化对出生后心脏的正常发育是不可或缺的。
图1. NAE1在出生后心脏的缺失导致心力衰竭
2.NAE1缺失损害CM的成熟
作者假设NAE1的缺失可能影响了心肌细胞（CM）成熟，继而引发NAE1敲除小鼠心肌病。对CM中的T小管进行标记及成像，观察到NAE1敲除的心肌细胞中T小管发育受到严重影响，表现为排列紊乱，含量、完整性和规律性显著降低，表明类泛素化对T小管组织至关重要。此外，低剂量AAV给药的NAE1F/F小鼠CM大小出现异常，同时，中剂量AAV处理的NAE1F/F小鼠心脏中，一些参与肌节和电生理成熟的基因发生了明显的胎儿和成人亚型表达变化，进一步证明了类泛素化在CM成熟中的重要作用。
图2. 抑制类泛素化会损害CM的成熟
3.NAE1缺失损害心脏氧化代谢和线粒体功能
围产期会发生从糖酵解到氧化代谢的转变，这是CM成熟和产后心脏发育所必需的。实时荧光定量PCR分析显示，与NAE1F/+小鼠心脏相比，中剂量AAV-Cre感染的NAE1F/F小鼠心脏中与脂肪酸利用有关的基因下调，而与葡萄糖利用的基因则显著上调。此外，western印迹也证实了NAE1敲除小鼠中调节脂肪酸利用的酶和参与线粒体生物发生的蛋白质减少。进一步分析显示NAE1CKO导致脂肪酸氧化基因acadm、Cpt1b、atgl mRNA水平显著降低，NAE1的缺失还造成了CMs线粒体功能障碍。
作者通过体外抑制新生大鼠心室心肌细胞（NRVCs）的NAE1表达，进一步证明抑制类泛素化可损害CMs中的脂肪酸氧化代谢，代谢组学分析结果更加表明，类泛素化显著影响CMs中葡萄糖和脂肪酸代谢相关途径。
图3. NAE1缺陷小鼠心脏脂肪酸氧化代谢和线粒体功能受损
小结
本研究确定类泛素化通过调节代谢转变，在心脏细胞成熟和出生后心脏发育中发挥重要作用。具体来讲，类泛素化作用修饰HIF1α和Cul2，并且这两种蛋白的类泛素化在促进HIF1α泛素化和降解方面具有协同作用，这对心脏发育中建立氧化代谢至关重要。抑制类泛素化会导致HIF1α蛋白的积累和持续的HIF1α信号通路，从而抑制妊娠晚期和产后心脏的脂肪酸利用，导致CM成熟缺陷，最终导致心力衰竭，表明类泛素化是CM成熟和围产期心脏发育所必需的。